خوشبختانه امروزه روش های مختلفی برای یافتن ناهنجاری در ژنوم انسان وجود دارد که روش QF-PCR از جمله همین موارد است. در عصر حاضر تعداد فرزندانی که مبتلا به ناهنجاری های جنسی و کروموزومی هستند، رو به افزایش است و چه بهتر که قبل از  تولد بتوان این مشکلات را تشخیص داد. به دنیا آمدن فرزندی که به بیماری های ژنتیکی مبتلا باشد و قرار است زندگی خود را با این نقص سپری کند، هم برای والدین و هم برای خود فرزند زمانی که بزرگتر می شود، سخت خواهد بود.

آشنایی با PCR و اساس کار آن:

قبل از اینکه به بررسی تکنیک QF-PCR  بپردازیم، لازم است کمی با روش PCR آشنا شویم. به منظور تکثیر   DNA، باید دو رشته ان از یکدیگر جدا شوند. در سال  1983 این تکنیک در امریکا کشف شد و توانست خدمت بزرگی به بشریت در امر تحقیقات در زمینه ژنوم داشته باشد.  با وجود این دستگاه می توان دماهای مختلف را تنظیم نموده و جداسازی رشته ها بدون آسیب دمایی به آن ها صورت گیرد. با اختراع این دستگاه، تکثیر و همانند سازی DNA  تسهیل شده و دقت بالاتری انجام گرفت. در این دستگاه، از پلیمرازهای مقاوم به حرارت و همچنین پرایمرها مورد نظر استفاده می شود. یکی از مهمترین شاخصه هایی که منجر به شهرت PCR شد، امکان تنظیمات دمایی در هر مرحله از تکثیر  DNA  است. برای نمونه دای جداسازی رشته ها، نزدیک به 95 درجه سانتیگراد و دمای اتصال پرایمرها به هر رشته، بین  60-50 درجه است.

آشنایی با روش QF-PCR
آشنایی با روش QF-PCR

آشنایی با روش QF-PCR:

Quantitative fluorescent PCR  که به اختصار QF-PCR نامیده می شود، در پی اختراع PCR  در سال 1993 به دنیا معرفی گردید. با توجه به اینکه با این روش بشر می توانست اختلالات مربوط به کروموزوم های جنسی را با دقت بالا ردیابی نماید، در نتیجه QF-PCR به سرعت در زمینه تحقیقات ژنتیکی گسترش یافت و در سال 2001 در کلینیک های مربوطه به کار گرفته شد.

در هر کروموزوم، توالی های تکرار شونده ای وجود دارد که تفاوت در تعداد این توالی های تکرار شونده، باعث می شود طول آن ها در کروموزوم های مختلف تفاوت داشته  و در نتیجه همین موضوع، منجر به تمایز میان افراد خواهد شد. با کمک QF-PCR و از طریق تکثیر توالی های تکرار شونده، می توان تعداد این کروموزوم ها را تعیین نمود.  در QF-PCR از پرایمرهای فلورسنت و PCR استفاده می شود.

تفسیر نتایج به دست آمده از QF-PCR :

نتایج به دست آمده بر روی نمودار را نشده و اکنون می توان از روی قله ها و ارتفاع آن ها تشخیص داد که فرد، نرمال بوده و یا به بیماری ناهنجاری کروموزومی مبتلا می شود:

  • حالت اول، الگوی آللی با دو قله هم اندازه (1:1)

اگر در یک محل مشخص از کروموزوم، دو قله هم اندازه دیده شود، به این معنا است که در این ناحیه دو کپی وجود داشته و فرد سالم و هتروزیگوت است. در افراد هموزیگوت و افرادی که به سندروم ترنر مبتلا هستند، یک قله مشاهده خواهد شد.

  • حالت دوم، افراد مبتلا به الگوی آللی تریزومی

در این افراد، یا 3 قله هم اندازه رویت شده (1:1:1) و یا اینکه همان حالت دو قله ای وجود داشته ولی یکی از قله ها، دو برابر دیگری است (2:1). در چنین مواردی، متخصصین اعتقاد دارند بارداری از نوع تریزومی بوده و این مشکل در زمان تقسیم میوز رخ داده است.

تفسیر نتایج QF-PCR
تفسیر نتایج QF-PCR

نواقص  و مشکلات روش QF-PCR:

بالاخره هر روش علمی، محدودیت هایی دارد که باعث می شود متخصصین برای رفع این مشکلات، به سراغ ابداع روش های تازه تر بروند. در مورد QF-PCR  نیز این مورد صدق می کند. دو محدودیت و نقص عمده  این تکنیک شامل:

  • عمده ترین محدودیت روش QF-PCR ، عدم تشخیص مشکلات ساختاری در کروموزوم ها است. شما در مورد هیچکدام از کروموزوم ها، نمی توانید اطلاعاتی در مورد مشکلاتی ساختمانی آن ها با دست بیاورید.
  • این امکان وجود دارد که از نتیجه آزمایش نتوان موقعیت نشانگر نسبت به کروموزوم را تشخیص داد. هر چند که این اتفاق به ندرت اتفاق می افتد، ولی در چنین مواردی متخصصین از روش کاریوتایپ استفاده نموده و نمونه ها را مورد بررسی قرار می دهند.
  • از دیگر مشکلاتی که در زمینه استفاده از روش وجود دارد این است که روش های آنالیزی برای نشانگرهای توالی نمی تواند بین افراد هموزیگوت و مونوزومی تفاوت قائل شود. در افرادی که مبتلا به بیماری سندروم ترنر هستند، تنها یک کروموزوم X وجود دارد. در افراد هموزیگوت نیز کروموزوم  XX دیده می شود. اکنون اگر ما نشانگر های مختص کروموزوم X را به کار ببریم نمی تواند میان این دو تمایز ایجاد شود.

مقایسه روش QF-PCR با روش FISH :

در میان روش هایی که برای تعیین ناهنجاری های کروموزومی به کار می رود، روش FISH نیز در برخی موارد مورد استفاده قرار می گیرد. اگر چه هر دو تکنیک را می توان برای تمامی کروموزوم ها اعمال نمود اما امروزه متخصصین معتقد هستند که روش QF-PCR نسبت به  FISH برتری دارد. دلایل این برتری عبارتند از:

  • تعداد سلول های مورد نیاز برای بررسی و آنالیز در QF-PCR کمتر است.
  • با کمک تکنیک QF-PCR می توان نمونه های بیشتری را مورد بررسی قرار داد.
  • روش از دقت بسیار بالاتری برخوردار بوده و در نتیجه نتیجه آن معتبرتر است.
  • یکی از دلایل اینکه روش QF-PCR به هزینه کمتری نیاز دارد، نیازمندی به نیروهای کاری کمتر است.
  • جالب است بدانید که روش QF-PCR را می توان برای تمام بانوان باردار اعمال نموده و محدودیتی از این نظر ندارد.
  • این امکان وجود دارد که با کمک متد QF-PCR ردیف های سلولی را در نمونه ها تعیین نمود.

بهترین زمان برای انجام تکنیک QF-PCR :

یکی از مواردی که در استفاده از روش QF-PCR باید مورد توجه قرار گیرد، زمان انجام این تکنیک است. اگر به موقع عمل نکنید، زمان از دست رفته و نمی توان برای این مشکل، چاره ای اندیشید. متخصصین معتقد هستند که بهترین زمان، قبل از چسبیدن جنین به دیواره رحم است. به عبارت دیگر قبل از اینکه جنین در بدن مادر لانه کند، باید آزمایش های ژنتیکی مورد نظر همانند تشخیص ناهنجاری کروموزومی انجام گیرد.