توالی یابی نسل جدید (NGS) روشی برای شناسایی جهش های ژنتیکی همزمان با اینکه در دهه های اخیر آمار نوزادان مبتلا به بیماری های ژنتیکی رو به افزایش است، اما علم نیز دست از کار نکشیده و قدرتمندتر از قبل با ابداع تکنیک هایی همانند توالی یابی نسل جدید (NGS) این امکان را فراهم می کند تا بتوان احتمال بروز جهش های ژنتیکی و بیماری های ناشی از ان را تشخیص داد. تکنیک توالی یابی نسل جدید (Next Generation Sequencing, NGS) یک روش بسیار دقیق و مطمئن است که  محدودیت های قبلی در تشخیص ناهنجاری های مادرزادی در بعد ژنتیکی را برطرف نموده است.

تاریخچه ابداع توالی یابی نسل جدید (NGS):

از زمانی که DNA کشف شد، متخصصین و محققین همواره به دنبال روش هایی برای توالی یابی ژنوم موجودات بوده اند. در سال 1970 سنگر و همکاران خود با استفاده از تکنیک های خاتمه زنجیره و تکه تکه شدن، روشی را برای تعیین توالی DNA ابداع نمودند که بعدها به دلیل نیاز کمتر به استفاده از مواد شیمیایی سمی و دست ورزی، به عنوان روش توالی یابی نسل اول شناخته شد که انصافا تحولات عظیمی را در علم ژنتیک به دنبال داشت. اما متاسفانه روش سنگر دارای محدودیت ها و معایبی بود من جمله:

  • محدودیت در قدرت عملیاتی این روش و مقیاس پذیری آن
  • محدودیت در سرعت و تفکیک پذیری
  • هزینه های مصرفی بالا
  • و…

توالی یابی نسل جدید (NGS)  روشی برای شناسایی جهش های ژنتیکی

همین چند مانع علمی کافی بود تا محققین برای دسترسی سریع، دقیق و کم هزینه به اطلاعات ژنوم هر موجود، به سراغ روشی جدید به نام  توالی یابی نسل جدید (NGS) بروند. جالب است بدانید که این روش همچنین تحت عنوان روش سنگر خودکار و یا توالی یابی انبوه موازی نیز شناخته شده است.توالی یابی نسل جدید (NGS) روشی برای شناسایی جهش های ژنتیکی

مزیت های توالی یابی نسل جدید (NGS):

قبل از اینکه به اساس کار  توالی یابی نسل جدید (NGS) در تعیین جهش های ژنتیکی بپردازیم، لازم است دلیل برتری این متد نسبت به تکنیک های قبلی را مرور کنیم:

  • در این روش نیازی به شبیه سازی باکتریایی قطعات DNA نخواهد بود. بلکه توالی یابی نسل جدید (NGS) مبتنی بر کتابخانه NGS است که مستقل از سلول کار می کند.
  • این امکان وجود دارد که میلیون ها واکنش توالی یابی را بتوان همزمان با کمک روش توالی یابی نسل جدید (NGS) انجام داد.
  • برای آنالیز نتایج در توالی یابی نسل جدید (NGS) نیازی به استفاده از الکتروفورز نخواهد بود.

مراحل انجام توالی یابی نسل جدید (NGS):

این تکنیک در 3 مرحله کلی انجام می شود:

  • تهیه کتابخانه NGS

همانگونه که در ابتدا بیان کردیم، توالی یابی نسل جدید (NGS) مبتنی بر کتابخانه NGS است. برای این منظور ابتدا نمونه ژنوم را استخراج نموده و به قطعات کوچک تقسیم می شود. سپس در انتهای این قطعات، آداپتورهایی وصل می شود تا کتابخانه آماده گردد.

  • تعیین توالی و تصویربرداری

اکنون می توان از هر کدام از قطعات موجود در کتابخانه به عنوان الگو استفاده نموده و رشته های جدید را ایجاد نمود. در ادامه، قطعات موجود با نوکلئوتیدهای شناخته شده، در کنار یکدیگر قرار می گیرند. این توالی به صورت دیجیتالی ثبت شده و قابل رویت خواهد بود.توالی یابی نسل جدید (NGS) روشی برای شناسایی جهش های ژنتیکی

  • آنالیز داده های حاصل

داده های به دست آمده تا این مرحله، خام هستند و برای اینکه جهت تشخیص جهش های ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرند باید تغییراتی را اعمال کنیم. در نتیجه باید آداپتورها و توالی هایی با کیفیت کم حذف شده و نقشه ژنتیکی تهیه شود. این نقشه می تواند به کمک یک ژنوم مرجع آماده گردد. در آنالیز داده ها می توان مواردی چون جهش های ژنتیکی، سطح بیان ژن و… تشخیص داد.

توالی یابی نسل جدید (NGS)  روشی برای شناسایی جهش های ژنتیکی

معرفی انواع توالی یابی نسل جدید (NGS):

زمانی که اولین روش توالی یابی نسل جدید (NGS) ابداع شد، محققین با پیشرفت تجهیزات و امکاناتی که به روزرسانی می شود، انواع روش های توالی یابی نسل جدید (NGS)  را معرفی نمودند که در ادامه به بررسی هر کدام خواهیم پرداخت:

  • توالی یابی کل ژنوم (WGS)

در این روش علاوه بر DNA هسته، DNA میتوکندریایی نیز مورد بررسی قرار خواهد گرفت. با توجه به اینکه این تکنین می تواند هزاران ژن فعال و توالی خاموش را مورد بررسی قرار داده و کارایی بالای 98 درصد دارد، در نتیجه به عنوان بهترین تکنیک در تشخیص جهش های ژنتیکی شناخته شده است.

  • توالی یابی اگزومی (WES)

با توجه به اینکه امروزه نزدیک به 10 درصد ماهیت ژنوم انسان شناسایی شده است، بنابراین محققین اینگونه بیان می کنند که جهت صرفه جویی در هزینه ها، بهتر است تنها توالی اگزونی، توالی مندلیوم (نواحی هایی که مربوط به ژن های کد کننده بیماری های شناخته شده هستند) و یا بخشی از ژنوم مربوط به ژن های بیمار را مورد مطالعه قرار داد. در این تکنیک به منظور اینکه بتوان به دقت بر روی ژن هدف کار کرد و از اثرات سایر نواحی ژنوم بر آن جلوگیری نمود، لازم است ژن هدف هزاران بار بیشتر از مقدار ان در ژنوم، غنی سازی شود. این تکنیک امروزه بسیار ارزشمند بوده و در تشخیص های بالینی مورد استفاده قرار می گیرد. مهمترین کاربردهای توالی یابی نسل جدید (NGS)  براساس توالی اگزومی عبارتند از:

  • تشخیص فنوتیپ های هتروژن همانند عقب ماندگی ذهنی، اختلال در فرآیند رشد، ناشنوایی، اختلالات متابولیکی، نابینایی ارثی، بیماری های قلب و…
  • فنوتیپ هایی که کاملا نامشخص بوده و یا علائم موجود، تشخیص افتراقی را دچار مشکل خواهد کرد.
  • تشخیص ژن های بزرگ همانند ژن های دیستروفن
  • توالی یابی هدفمند

این روش از توالی یابی نسل جدید (NGS)  به دلیل اینکه از نظر زمانی و هزینه بسیار مقرون به صرفه تر بوده و قسمت های بیشتری از ژنوم را تحت پوشش خود قرار می دهد، امروزه به عنوان یک تکنیک پرکاربرد شناخته شده است. در این تکنیک، قسمت هایی از ژنوم تحت عنوان پانل طراحی شده اند که منبع اصلی جهش های ژنتیکی هستند. با توجه به اینکه پانل ها دقیقا بخش خاصی از ژنوم را پوشش می دهند، می توان برای تعین نوع خاصی از بیماری از آن ها استفاده نمود.

تکنیک توالی یابی نسل جدید (NGS)

  • توالی یابی RNA

نوعی دیگر از تکنیک توالی یابی نسل جدید (NGS)  مبتنی بر توالی یابی RNA است. در این روش می توان از محتوای ژنی هر سلول تصویربرداری نمود.

  • توالی یابی DNA میتوکندریایی

با توجه به اینکه تکرارهای DNA میتوکندریایی متفاوت است، حدس زده شده است که همین موضوع منجر به بروز بیمارهایی همانند سرطان می شود. در نتیجه استفاده از روش توالی یابی DNA میتوکندریایی به تشخیص اختلالات میتوکندریایی کمک خواهد نمود.