سیر تحولات روش های تعیین توالی ژنوم از ابتدا تاکنون از زمان کشف DNA ، روش های تعیین توالی ژنوم برحسب امکانات روز مورد استفاده قرار گرفت تا متخصصین از این طریق بتوانند وضعیت ژنوم هر موجود را بررسی و نسل آینده را پیش بینی کنند. این موضوع تنها در بعد انسانی اهمیت نداشت بلکه در پرورش گیاه و دام به منظور رسیدن به محصولات بیشتر و دام هایی با بازدهی بالاتر، مهمترین هدف تعیین توالی ژنوم در این موجودات بود.

سیر تحولات روش های تعیین توالی ژنوم از ابتدا تاکنون

بررسی روش های تعیین توالی ژنوم:

سیر تحولات روش های تعیین توالی ژنوم از ابتدا تاکنون بشر همواره در حال تلاش برای یافتن متدهایی بوده است که در کوتاه ترین زمان، با کمترین سختی و با کیفیت بالا بتواند ژنوم موجودات را مورد بررسی قرار دهد. همین امر منجر به پیدایش تنوع در روش های تعیین توالی شده است که در ادامه به بررسی هر کدام خواهیم پرداخت:

  • تعیین توالی ژنوم مبتنی بر کروماتوگرافی دو بعدی

این روش در سال 1970 توسط پژوهشگران ابداع و اولین توالی یابی های ژنوم صورت گرفت. مهمترین عیب این متد، سختی و مشقت بالا در حین انجام بود. همین مشکل منجر به این شد که متخصصین به فکر یافتن روشی دیگر برای تعیین توالی ژنوم باشند.

  • تعیین توالی ژنوم مبتنی بر مواد رادیواکتیو

در همین دهه و در سال 1973 و ماکسام روشی را برای توالی یابی ژنوم مورد استفاده قرار دارند که از طریق برش شیمیایی و مواد رادیواکتیو، عملی می شد. اما مهمترین عیب این روش در کنار سختی بالا، مضر بودن مواد رادیواکتیو برای بدن بود.

  • تعیین توالی ژنوم براساس متد ختم زنجیره

این متد در سال 1977 توسط سانگر و همکارانش ابداع شد به همین دلیل به عنوان روش تعیین توالی سانگر شناخته شده است. برای این منظور، از طریق وارد کردن ddNTP در نقاط مختلف DNA ، ختم سنتز DNA در حال صورت گرفته و قطعات کوچک ژنوم از هم جدا می شوند. مزیت عمده این تکنیک نسبت به روش قبل باعث شد که تا نزدیک به 30 سال پژوهشگران این روش تعیین توالی ژنوم را در تحقیقات خود به کار ببرند. تکنیک ختم زنجیره به مواد شیمیایی سمی و رادیوایزوتوپ های کمتر نیاز داشت که منجر به برتری آن می شد. جالب است بدانید که اولین توالی یابی ژنوم انسان در سال 2004 و توسط همین روش انجام گرفت. از این زمان به بعد، روش سانگر به عنوان نسل اول فناوری تعیین توالی ژنوم معرفی شد.

نسل دوم فناوری تعیین توالی ژنوم:

همانگونه که بیان کردیم اولین روش تعیین توالی ژنوم که موفقیت آمیز عمل نمود، روش سانگر بود اما با توجه به اینکه هزینه بر و زمان بر بوده و از این پس پژوهشگران به دنبال یافتن راه های سریع و ارزان برای بررسی ژنوم انسان بودند، موسسه بین المللی تحقیقات ژنوم انسان (NHGRI)  برنامه ای را مبنی بر توسعه فناوری تعیین توالی نسل دوم مدون نمود. در نسل دوم، شاهد سه پیشرفت بسیار مهم هستیم که در نسل اول رویت نشد:

  • در نسل دوم توالی یابی ژنوم نیازی به استفاده از کلونینگ باکتری برای آماده سازی قطعات نبود بلکه این کار با استفاده از سیستم های خارج سلولی انجام می گرفت.
  • روش های تعیین توالی ژنوم در نسل دوم محدودیتی از نظر تعداد واکنش ها نداشت به آن معنا که محققین می توانستند میلیون ها واکنش را به طور همزمان انجام دهند.
  • یکی دیگر از مهمترین مزیت های فناوری تعیین توالی ژنوم نسل دوم، عدم نیاز به الکتروفورز برای به دست آوردن نتایج بود.
  • سیر تحولات روش های تعیین توالی ژنوم از ابتدا تاکنون

روش های تعیین توالی ژنوم به قدرت عملیاتی بالا:

سیر تحولات روش های تعیین توالی ژنوم از ابتدا تاکنون روش های تعیین توالی نسل دوم علی رغم تمامی مزیت ها، دارای دو عیب بزرگ بودند:

  • کوتاهی طول توالی خوانده شده

  • انحرافات رخ داده در فرآیند تکثیر

فناوری تعیین توالی ژنوم نسل سوم این محدودیت ها را رفع نموده و اکنون تکنیک هایی برای توالی یابی ژنوم مورد استفاده قرار می گیرند که عملکرد بسیار بالایی دارند. این روش ها عبارتند از:

  • تعیین توالی ژنوم به روش Roche/454 pyrosequencing

این روش در سال 2005 توسط شرکت  454 Life Science معرفی شده و سپس امتیاز ان به شرکت Roche واگذار گردید. در این تکنیک ابتدا باید کتابخانه ای از قطعات DNA تهیه نموده و تمامی قطعات به مهره های 28 میکرونی حاوی پرایمر متصل شوند. در نهایت این قطعات بر روی پلیت هایی با میلیون ها چاهک ران می شوند و خوانش صورت می گیرد.

  • تعیین توالی ژنوم به روش Illumina

در سال 2006 توسط شرکت Solexa دستگاه تعیین توالی به نام Genome Analyzer II ساخته شد و امتیاز آن به شرکت Illumina واگذار گردید. توالی یابی در این روش مبتنی بر سنتز DNA است. پس از تکثیر، از هر قطعه تقریبا یک میلیون نسخه به دست می آید که به صورت خوشه های متمرکز قرار خواهند گرفت. سپس خوشه ها به صورت تک رشته تبدیل می شوند و در مرحله بعد 4 نوع dNTP هر کدام حاوی نوعی فلورسنت، توسط DNA پلیمراز به تک رشته ها متصل می شوند تا رونویسی صورت گیرد.

  • تعیین توالی ژنوم مبنی بر روش SOLiD

در پایان سال 2007 توسط Applied Bioscience فناوری تعیین توالی ژنوم به صورت تجاری و با نام SOLiD وارد بازار شد. این متد نیز براساس کتابخانه ای از قطعات DNA و  تکثیر این قطعه ها بر روی دانه های پوشیده از پرایمر انجام می گیرد. لازم است بدانید که در این تکنیک به جای استفاده از آنزیم DNA پلیمراز برای تکثیر، از آنزیم لیگاز استفاده می شود.

  • تعیین توالی ژنوم به روش Ion Torrent

در سال 2010 دستگاه توالی یابی ژنوم نیمه رسانا تحت عنوان Ion Torrent توسط Life Technologies ساخته و به صورت تجاری وارد بازار شد. جالب است بدانید که این تکنیک نیز همانند روش Roche/454 pyrosequencing بوده با این تفاوت که برای توالی یابی، از واکنش های نوری استفاده خواهد کرد. با توجه به این که تکنیک Ion Torrent نیاز به فلورسنت را حذف کرده است، منجر به افزایش سیگنال شده و این امکان را فراهم می کند که توالی هایی با طول بلندتر ار بتوان با دقت تشخیص دهیم. در سال 2012 همین شرکت دومین دستگاه توالی یابی ژنوم را وارد بازار نمود که خروجی ان نسبت به دستگاه قبلی بیشتر بود.

سیر تحولات روش های تعیین توالی ژنوم از ابتدا تاکنون

  • تعیین توالی ژنوم به روش SMRT

این فناوری در سال 2010 در کانادا توسط Pacific Bioscience  راه اندازی شد و این امکان را فراهم نمود تا بتوان سنتز DNA را بررسی کنیم چرا که براساس روش طبیعی همانند سازی DNA پایه گذاری شده است.